聖歌は伝統的には男声に限られ、元来はミサや聖務日課の祈りにおいて、男性聖職者によって歌われていた。しかし、大都市を除いては聖職者の数は限られていたから、次第に世俗男性も合唱に加わるようになった。女子修道院（コンヴェント）では、女性も修業生活の一貫として、ミサ及び聖務日課で歌うことが認められていたが、聖歌隊に加わることは聖職者にのみ許される公的義務とされていたため、世俗女性がスコラ・カントルムなどの聖歌隊で歌うことは認められていなかった。
聖歌は通常、斉唱（ユニゾン）で歌われたが、後には、聖歌に歌詞や音を追加するトロープスや、即興的にオクターブ、5度、4度（後には3度も）の和声を重ねるオルガヌムなどの技法が開発される。しかしトロープスもオルガヌムも、本来の聖歌の曲目に含まれるものではない。これの主要な例外としてはセクエンツィア（続唱）がある。セクエンツィアは、「ユルビス」と呼ばれるアレルヤ唱の引き伸ばされたメリスマ（alleluiaの最後のaを長くのばす）をトロープスにするところから発展したものである。しかし、トロープスもセクエンツィアも、トリエント公会議によってほとんど禁止された。トリエント公会議では、復活祭、ペンテコステ、聖体祝日および死者の日のためのものを残して、セクエンツィアが禁止された。
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中世にグレゴリオ聖歌の歌唱に、実際にどのような歌唱法が用いられていたのかはほとんどわかっていない。時には聖職者が歌い手に対して、もっと抑制的に、敬虔に歌うように要求していることから、しばしば高度に技巧的な演奏も行われていたことが窺われ、それは「ゆっくりとたゆたう癒しの音楽」という今日のグレゴリオ聖歌のステレオタイプ・イメージとはかなり異なっていたと推測される。